熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別,進而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決。總的來說,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實驗手段。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 產(chǎn)品名稱 | 枯草芽孢桿菌探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Bacillus subtilis | 貨號 | YSP96419 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團,3'端標(biāo)記淬滅基團。 正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當(dāng)擴增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點: 成本高; 設(shè)計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 氯化木蘭花RCAS1 (D6P5J) Rabbit mAb5-氯色鹽酸鹽 木蘭花PANK4 (D8N2C) Rabbit mAb對叔丁基乙酮 化木蘭花Tip60 Antibody2-氨基-氟吡啶 去甲烏藥鹽酸鹽(標(biāo)準(zhǔn)品)p70 S6 Kinase Blocking Peptide2-氟-甲氧基 去甲烏藥鹽酸鹽Gö6976溴甲基肉桂酸甲酯 二氫歐山芹素 (標(biāo)準(zhǔn)品)PhosphoPlus® Cleaved PARP (Asp214) Antibody Duet鄰乙氧基酚 異澤蘭黃素(標(biāo)準(zhǔn)品)AMPKβ1 Antibody2,二氯氯芐 利莫那班羧酸Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjuga)2,二氯 玉米黃質(zhì)Paxillin (D9G12) Rabbit mAb5-氨基并咪唑酮 三亞乙基硫代酰MASTL (D3J4Y) Rabbit mAb(R)-甲基嗎啉鹽酸鹽 普拉克索PathScan®Phospho-c-Abl (Tyr412) Sandwich ELISA Kit2-氟甲 普拉克索(標(biāo)準(zhǔn)品)SPHK1 (D1H1L) Rabbit mAb2-氯-5- 染料木素/金雀異黃酮Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjuga)氯間二酚 染料木素/金雀異黃酮(標(biāo)準(zhǔn)品)β-Amyloid (1-39 Specific) (D5Y9L) Rabbit mAb8-氟喹唑啉-(2,4)二酮 酚MCM2 (1E7) Mouse mAb羥乙酸甲酯 酚(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-Syk (Tyr525/526) (C87C1) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjuga)2-溴-氯吡啶 木犀草素HMGA1 (D4F8) Rabbit mAb5-氯-2-氟甲 木犀草素(標(biāo)準(zhǔn)品)PGAM1 (D3J9T) Rabbit mAb甲基-甲酸 枯草芽孢桿菌探針法熒光PCR檢測試劑盒17-酮類固(17-KS)ELISA試劑盒DACH2 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子DACH2抗體100 ul 17羥孕酮(17-OHP)ELISA試劑盒DARPP32 多巴、cAMP調(diào)節(jié)蛋白抗體100 ul 17羥皮質(zhì)類固(17-OHCS)ELISA試劑盒Phospho-DARPP32 (Thr34) 酸化多巴/cAMP調(diào)節(jié)神經(jīng)蛋白抗體20 ul 17-α甲睪酮(17-αMT)ELISA試劑盒Phospho-DARPP32 (Thr75) 酸化多巴/cAMP調(diào)節(jié)蛋白抗體100 ul 16α羥基雌酮1(16-α OHE-1)ELISA試劑盒DRD1 多巴受體D1抗體20 ul 15脂加氧酶(15-LO/LOX)ELISA試劑盒DRD2 多巴受體D2抗體100 ul 12羥二十烷四酸(12-HE)ELISA試劑盒DRD3 多巴受體D3抗體20 ul 1,4,5-三酸肌(IP3)ELISA試劑盒DAT1 多巴轉(zhuǎn)運蛋白抗體100 ul 1,3-βD葡葡糖苷酶(1,3-βD-Glu)ELISA試劑盒DRD4 多巴受體D4抗體100 ul PCR技術(shù)的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應(yīng)擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應(yīng)的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進入“平臺期”。在該時期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 |