樣品采集 選擇無口腔軟組織炎癥、無牙周疾病的志愿者31例,男性14人,女性17人,年齡16～40歲。采樣前24小時禁止口腔衛(wèi)生,正常飲食。樣品采集前用清水充分漱口以去除食物殘渣及軟垢。收集自然非刺激性混合性唾液1 ml,為對照組;再用棉墊隔離牙菌斑收集區(qū),用無菌蠟刀和探針刮取全牙面菌斑（下頜前牙區(qū)除外）,用菌斑染色劑檢測所取部位,若該部位仍殘留部分菌斑,則上述所取菌斑為有效,為實驗組。否則為無效。取樣均在上午8～9時,10時進(jìn)行發(fā)光強(qiáng)度測定。
實驗步驟 先測定發(fā)光值強(qiáng)度。測定條件為25 ℃,60秒。實驗組樣品加1.0 ml NS,勻漿管內(nèi)勻漿,取0.1 ml勻漿液置于化學(xué)發(fā)光管中,分別加NS或SOD液10 μl測定本底后,加L液0.1 ml進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測定,得到（NS+L）組和（SOD+L）組發(fā)光值。同法取0.1 ml唾液分別加（NS+L）和（SOD+L）測定發(fā)光值作為對照組值。
蛋白定量 采用考馬斯亮藍(lán)法測定。取0.5 mg/ml牛血清白蛋白10 μl（即5 μg）作標(biāo)準(zhǔn),生理鹽水10 μl為空白對照,剩余勻漿液或唾液5 μl加生理鹽水5 μl為樣品。然后加考馬斯亮藍(lán)試劑200 μl?；靹蚍胖?0分鐘,600 nm波長測吸光度（A）值。根據(jù)（A）值得到每份樣品的蛋白含量,進(jìn)而得到樣品中每毫克蛋白每秒發(fā)光值。
本實驗結(jié)果表明,實驗組與對照組均含有超氧化物陰離子自由基,實驗組中超氧化物陰離子自由基的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組,兩組之間的抑制發(fā)光強(qiáng)度值比為29.1/0.36=81倍,即菌斑內(nèi)自由基含量明顯高于唾液內(nèi)自由基含量。
本測定結(jié)果,菌斑中自由基的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于唾液中自由基水平,可以排除因唾液自由基水平升高繼而造成菌斑中自由基水平升高的可能性。同時,菌斑附著牙面的牙體硬組織代謝活動不可能產(chǎn)生如此高濃度的自由基。因此,本實驗檢測到的超氧化物陰離子自由基只可能是由菌斑組織的存在而產(chǎn)生的。
本測定結(jié)果可見SOD對菌斑發(fā)光強(qiáng)度抑制率明顯高于對唾液發(fā)光強(qiáng)度的抑制,說明SOD對超氧化物陰離子自由基的特異性抑制作用,也說明所取菌斑樣品并非食物殘渣或軟垢。食物殘渣或軟垢中可能有發(fā)光物質(zhì)的存在,但SOD并不抑制其發(fā)光,SOD只可能抑制細(xì)菌代謝過程中產(chǎn)生的超氧化物陰離子自由基。
